Produksi Antibodi Monoklonal (McAb) untuk Deteksi Virus

Kerdil Hampa Padi: Produksi Hibridoma Penghasil McAb

Jumanto, M. Machmud, Ifa Manzila, dan Yadi Suryadi

Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian

ABSTRAK

Teknik produksi antibodi monoklonal telah diadopsi untuk menghasilkan McAb RRSV. Hibridan mencit Balb c diimunisasi dengan antigen RRSV secara ber-kala dengan interval seminggu. Limposit dipanen dari limpa mencit yang telah diimunisasi, selanjutnya difusikan dengan sel mieloma SP2/O-Ag14 untuk mem-peroleh hibridoma yang selanjutnya diseleksi untuk memperoleh hibridoma penghasil McAb RRSV. Skrining hibridoma hasil fusi memperoleh 10 koloni hibridoma yang menghasilkan McAb. Seleksi lebih lanjut memperoleh dua nomor koloni hibridoma yang potensial menghasilkan McAb RRSV tinggi, yaitu RR-(2)-3 C10 dan RR-(3)-2 H03. Koloni hibridoma ini disimpan secara kriogenik dalam tabung berisi nitrogen cair. Hibridoma ini akan digunakan sebagai sum-ber untuk kloning guna memperoleh koloni satu sel hibridoma yang potensial memproduksi McAb tinggi, stabil dan mempunyai reaksi spesifik.

Kata kunci: Antibodi monoclonal, deteksi dan identifikasi, RRSV, padi

PENDAHULUAN

Penyakit kerdil hampa (Ragged Stunt) yang disebabkan virus kerdil hampa padi (Rice Ragged Stunt Virus, RRSV) merupakan salah satu penyakit yang berpotensi menurunkan produksi padi di Indonesia. Penyakit ini telah dilaporkan tersebar luas di Indonesia sejak 1977 (Hibino et al., 1977; Ou, 1985; Palmer et al. 1978). Epidemi penyakit ini terjadi di Indonesia pada periode tahun 1985-1987 dan mengakibatkan kerusakan yang serius pada pertanaman padi (Jumanto, komunikasi pribadi). Sejak saat itu, penyakit yang ditularkan oleh wereng coklat (WCk, Nilaparvata lugens Stahl) ini tidak begitu parah, walaupun masih selalu dijumpai di lapang. Akhir-akhir ini terdapat kecenderungan terjadinya kembali epidemi penya-kit kerdil hampa di lapang, sehingga peluang terjadinya ledakan penyakit ini perlu diwaspadai. Informasi tentang epidemiologi penyakit kerdil hampa dan ekologi patogennya sangat diperlukan untuk menunjang keberhasilan pengendaliannya, tetapi hal ini belum banyak diteliti di Indonesia. Deteksi dini suatu patogen dari tanaman, benih, dan serangga penular juga sangat membantu upaya pengendaliannya baik secara langsung maupun mencegah penularan penyakit. Deteksi virus patogen seperti RRSV menggunakan uji kisaran inang memerlukan waktu lama, sehingga perlu dikembangkan teknik yang cepat dan akurat. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan salah satu teknik serologi yang dapat digunakan untuk mendeteksi patogen tanaman secara efektif dan efisien (Halk dan De Boer, 1985). Teknik ELISA dan perangkat deteksinya menggunakan antibodi poliklonal (PAb) atau McAb telah dikembangkan secara komersial untuk deteksi virus dan bakteri patogen tanaman (Martin, 1985; Van Regenmortel, 1986). Teknik ELISA juga telah diadopsi di Indonesia, tetapi perangkatnya masih harus diimpor dengan harga mahal. Sejak tahun anggaran 1995/96 di Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor, telah dirintis produksi antibodi dan pembuatan perangkat ELISA. Pada tahun 1999 telah dikembangkan teknik produksi PAb terhadap virus tungro (Rice Tungro Virus, RTV), virus kerdil kedelai (Soybean Stunt Virus, SSV), virus bilur kacang tanah (Peanut Stripe Virus, PStV), dan virus mosaik kedelai (Soybean Mosaic Virus, SMV) dengan menggunakan PAb (Machmud et al., 1999). Penggunaan PAb untuk uji ELISA memiliki beberapa kelemahan, sehingga sejak tahun 1975, teknologi produksi antibodi monoklonal (monoclonal antibody, McAb) telah dikembangkan (Kohler dan Milsten, 1975; Carter dan Ter Meulen, 1984; Gigerli dan Fries, 1983). McAb dari PAb di antaranya (1) reaksi McAb dapat dibuat spesifik strain, dari satu patogen dapat dibuat beberapa McAb dengan spesifikasi tertentu sesuai kebutuhan; (2) antibodi yang dihasilkan mempunyai kualitas yang stabil serta berkesinambungan; (3) pasokan antibodi dalam jumlah besar mudah dilakukan, dan (4) teknologi McAb hanya modal awal yang relatif mahal, tetapi selanjutnya menjadi murah (Jordan, 1990). McAb telah diproduksi untuk berbagai patogen tanaman termasuk virus, fitoplasma, dan bakteri (Converse dan Martin, 1990).

Tahapan produksi McAb meliputi imunisasi mencit, penyediaan dan fusi sel limpa dan sel mieloma, dan seleksi hibridoma penghasil McAb. Makalah ini merupakan hasil kegiatan penelitian tahun 2002 yang bertujuan untuk memproduksi hibridoma penghasil McAb untuk deteksi dan identifikasi RRSV.

BAHAN DAN METODE

Peralatan dan Bahan

Peralatan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah ruangan khusus untuk pembiakan hibridoma, ruang isolasi (laminar air flow), inkubator CO2 bersuhu 37 C, mikroskop (inverted microscope) dan mikroskop floresen, sentrifus meja, otoklaf, waterbath 37-56 C, alat penyimpanan kriogenik, alat kering beku (freeze dryer), pendingin (freezer -15 C dan -80 C, hemasitometer, spektrofotometer, mikropipet 0-200 l, mikropipet 1000 l, multipipettor 8 lubang, filter milllipore ukuran 0,22 m. Peralatan dan bahan untuk membiakkan sel microplate) bertutup dengan 96 lubang; botol kultur sel ber-diameter 25, 75, dan 150 cm; pipet gelas atau plastik berukuran 1, 5, 10, dan 25 ml; ampul berukuran 1 ml; tabung sentrifus bertutup berukuran 5, 15, dan 50 ml; cawan petri bulat dan persegi, pipet pastur, sarung tangan plastik, spuit plastik berukuran 1, 10, dan 50 ml; jarum suntik berukuran 26 dan 16 G, serta gunting operasi. Di samping peralatan laboratorium mencit (tikus putih) hibrida Balb/c beserta ruangan dan kandang untuk pemeliharaan juga diperlukan. Mencit sebagai hewan untuk imunisasi dan sumber limposit. Bahan-bahan untuk pembuatan sediaan limposit, biakan sel mieloma, dan biakan sel hibridoma adalah Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), medium hypoxanthine aminopterine Newly thymidine (HAT), antibiotik kanamisin, serum anak sapi yang baru lahir (Born Calf Serum, NBS), medium hypoxanthine thymidine (HT).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Imunisasi Mencit

Contoh darah diambil empat hari setelah imunisasi terakhir dan diproses untuk memperoleh antibodi poliklonal (PAb) RRSV dan diuji titernya menggunakan teknik mikropresipitasi. Hasilnya menunjukkan darah bereaksi positif berdasarkan uji mikropresipitasi. Hal ini menunjukkan adanya respon antibodi dari mencit ter-hadap antigen RRSV yang disuntikkan. Setelah diketahui bahwa mencit telah memproduksi PAb, pada hari yang sama mencit dimatikan untuk diambil limpa-nya.

Penyediaan dan Fusi Sel Mieloma dan Limposit

Sel mieloma yang dibiakkan pada medium DMEM + NBS + L glycine tumbuh baik berupa koloni sel yang terdapat di dasar medium. Biakan sel mieloma 10 sel/ml. Sel limposit diperoleh yang berumur 72 jam menghasilkan kerapatan dalam bentuk cairan/suspensi dalam medium DMEM-NBS. Setiap mencit menghasilkan 10 limposit, sehingga dari 5 ekor mencit diperoleh 5 x 10 limposit. Fusi sel mieloma dengan sel limposit mencit yang telah diimunisasi dengan RRSV menghasilkan fusan sel hibridoma. Hal ini ditunjukkan adanya pertumbuhan biakan sel pada dasar medium. Hasil fusi hanya mencapai 29,7% dan sel hibridoma yang diperoleh tidak semuanya menghasilkan McAb, sehingga perlu dilakukan skrining untuk memperoleh sel hibridoma penghasil McAb.

Skrining Sel Hibridoma

Pada skrining I, dari 297 suspensi koloni hibridoma dalam lubang cawan mikro yang diuji dengan teknik ELISA diperoleh 14 koloni hibridoma yang menghasilkan McAb RRSV (Tabel 1). Kemampuan menghasilkan McAb dari setiap koloni sel hibridoma berbeda-beda dengan angka kerapatan optik pada panjang gelombang 415 nm (OD) yang berkisar antara 0,03-1,29. Hibridoma pada lubang cawan nomor RR-(3)-2 H03, RR-(3)-1 H11, RR-(1)-3 C07, dan RR-(2)-3 C04 menghasilkan McAb rata-rata tertinggi. Angka rata-rata OD hasil uji dari suspensi keempat biakan hibridoma tersebut menggunakan teknik AAI-ELISA secara berturut-turut adalah 0,68; 0,64; 0,40; dan 0,55, sedangkan menggunakan teknik IDAS-ELISA masing-masing adalah 1,22; 0,83; 0,88; dan 0,64. Skrining II dilakukan untuk memperoleh biakan hibridoma yang potensial menghasilkan McAb tinggi dan stabil untuk digunakan sebagai sumber penghasil McAb selanjutnya. Pada skrining II diperoleh dua suspensi biakan sel hibridoma penghasil McAb yang potensial berdasarkan kemampuan menghasilkan McAb yang tinggi dan stabil, yaitu RR-(2)-3 C04 dan RR-(3)-2 H03. Kedua suspensi hibridoma masing-masing 1,03 dan 0,68 mengguna-kan menunjukkan angka rata-rata OD teknik AAI-ELISA, serta berturut-turut 1,59 dan 1,22 menggunakan teknik IDAS-ELISA

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Fusi sel mieloma SP/2-O AG14 dengan limposit mencit Balb/c yang telah di-

imunisasi dengan virus kerdil hampa padi (RRSV) dapat menghasilkan sel

hibridoma penghasil antibodi terhadap RRSV.

2. Skrining sel hibridoma penghasil McAb RRSV memperoleh dua kandidat

hibridoma yang potensial memproduksi McAb cukup tinggi, yaitu RR-(2)-3 C04

dan RR-(3)-2 H03, yang potensial untuk dijadikan sumber kloning hibridoma

lebih lanjut.

Saran

1. Koloni sel hibridoma yang potensial sebagai sumber McAb RRSV (RR-(2)-3 C04

dan RR-(3)-2 H03) perlu dikloning lebih lanjut untuk memperoleh koloni

hibridoma satu sel yang potensial untuk digunakan sebagai sumber utama

produksi McAb RRSV pada skala pilot.

2. Penelitian ini perlu dilanjutkan agar koloni hibridoma yang telah dihasilkan

dapat dipertahankan kehidupannya melalui penyimpanan kriogenik, sehingga

apabila suatu saat diperlukan dapat diperbanyak kembali untuk menghasilkan

McAb RRSV.

3. Laboratorium biakan sel perlu disediakan untuk keperluan

scale up produksi

McAb.